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對(duì)生豬養(yǎng)殖業(yè)而言，非洲豬瘟是當(dāng)前最具危險(xiǎn)性的傳染疾病之一自2018年冬季傳入我國(guó)以來(lái)以對(duì)我國(guó)生豬養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了巨大損失。非洲豬瘟是由非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）引起的一種高度接觸性，致死率極高的烈性傳染病。由于非洲豬瘟臨床癥狀與豬瘟（CSF）和豬繁殖與呼吸障礙綜合征（PRRS）等病癥極其相似，所以僅通過(guò)臨床癥狀無(wú)法區(qū)分，因此需要使用分子生物學(xué)手段對(duì)非洲豬瘟病毒進(jìn)行檢測(cè)，以做到對(duì)非洲豬瘟病毒及時(shí)、快速、準(zhǔn)確的診斷，以確保將非洲豬瘟的威脅性降到最低。筆者將簡(jiǎn)述目前常見(jiàn)的非洲豬瘟病毒檢測(cè)方法及注意事項(xiàng)，以期為生豬養(yǎng)殖從業(yè)人員在非洲豬瘟病毒檢測(cè)及非瘟防控提供參考。

1 非洲豬瘟病毒檢測(cè)方法

1.1 病原學(xué)檢測(cè)

ASFV的病原學(xué)檢測(cè)，主要有聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）、微滴數(shù)字PCR（Droplet Digital PCR, ddPCR）、線性指數(shù)PCR、重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)（RPA）、原位雜交技術(shù)（ISH）、環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）、探針雜交技術(shù)等。

PCR檢測(cè)：PCR是疫病最早期采用的檢測(cè)方法，非洲豬瘟病毒的PCR檢測(cè)是根據(jù)其基因中的高度保守區(qū)序列，設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，檢測(cè)和鑒定屬于所有已知病毒基因型的廣泛分離株。依據(jù)世界動(dòng)物衛(wèi)生組織推薦的的PCR檢測(cè)方法，可以擴(kuò)增出22株不同的ASFV病毒，但傳統(tǒng)PCR方法由于耗時(shí)較長(zhǎng)且對(duì)設(shè)備要求高，因此并未廣泛應(yīng)用于養(yǎng)殖一線。

巢式PCR：采用內(nèi)外兩對(duì)PCR引物，可以在檢測(cè)組織、血液樣品和培養(yǎng)物的基礎(chǔ)上，檢測(cè)昆蟲(chóng)體內(nèi)所帶的ASFV。巢式PCR克服了單次擴(kuò)增平臺(tái)期效應(yīng)的限制，使擴(kuò)增倍數(shù)提高，從而極大的提高了PCR的敏感性；并且因?yàn)?span>模板和引物的改變，降低了非特異性反應(yīng)連續(xù)放大進(jìn)行的可能性，保證了反應(yīng)的特異性；由于內(nèi)側(cè)引物擴(kuò)增的模板是外側(cè)引物擴(kuò)增的產(chǎn)物，第二階段反應(yīng)能否進(jìn)行，也是對(duì)第一階段反應(yīng)正確性的鑒定，因引此可以保證整個(gè)反應(yīng)的準(zhǔn)確性及可行性。

熒光定量PCR：熒光定量PCR是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上對(duì)某些特定基因如p72、p54、K205R等設(shè)計(jì)引物和探針，使得檢測(cè)特異性和敏感性得到了較大的提升。非洲豬瘟傳入中國(guó)以來(lái)，由于部分豬場(chǎng)已經(jīng)出現(xiàn)CSFV、ASFV以及PRRSV混合感染的情況。因此，利用多重PCR技術(shù)不但可對(duì)混合感染的豬只做及時(shí)和準(zhǔn)確的診斷，而且還能極大程度減少檢測(cè)耗材的使用，縮短檢測(cè)時(shí)間。

微滴數(shù)字PCR檢測(cè)：ddPCR比普通熒光定量具有更高的敏感性和特異性，其采用終點(diǎn)稀釋方法實(shí)現(xiàn)了最小劑量單分子病毒的擴(kuò)增，進(jìn)而計(jì)算出樣品的起始濃度，最終達(dá)到對(duì)病毒含量的絕對(duì)定量。但由于微滴數(shù)字PCR需要使用較為昂貴的儀器設(shè)備和試劑，因此很難用于大規(guī)模樣品的檢測(cè)。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)：是一種“簡(jiǎn)便、快速、精確、低價(jià)”的基因擴(kuò)增技術(shù)，可做到快速檢測(cè)非洲豬瘟病毒，通常30分鐘即可完成檢測(cè)。與常規(guī)PCR相比，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增不需要模板的熱變性、溫度循環(huán)、電泳及紫外觀察等過(guò)程，因此對(duì)儀器設(shè)備的要求較低，便于在養(yǎng)殖場(chǎng)、屠宰場(chǎng)、飼料廠進(jìn)行快速檢測(cè)，該檢測(cè)方法也是目前生產(chǎn)一線最常用的非洲豬瘟病毒檢測(cè)方法之一。

重組聚合酶擴(kuò)增技術(shù)：重組聚合酶擴(kuò)增技術(shù)是一種新興的分子學(xué)檢測(cè)方法，目前也被應(yīng)用于ASFV的檢測(cè)中，其原理類似于體內(nèi)的DNA的復(fù)制過(guò)程，通過(guò)生成重組酶-DNA復(fù)合物來(lái)啟動(dòng)DNA的合成，進(jìn)而進(jìn)行目標(biāo)區(qū)域的指數(shù)式擴(kuò)增。由于RPA的反應(yīng)溫度介于37-42℃之間，舍去了常規(guī)實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)中加熱到退火的過(guò)程，所以其反應(yīng)時(shí)間可以縮短至20分鐘左右。該方法在保證了擴(kuò)增敏感性和特異性的同時(shí)，又極大的縮短了檢測(cè)時(shí)間。

下圖為實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)檢測(cè)非洲豬瘟病毒的基本原理（圖1）。

圖 1實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)原理

1.2 血清學(xué)檢測(cè)

利用抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行的抗原檢測(cè)和抗體檢測(cè)，是血清學(xué)檢測(cè)的兩種重要手段。針對(duì)ASFV抗原的檢測(cè)方法主要有熒光抗體試驗(yàn)、雙抗夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、膠體金免疫層析法等；針對(duì)ASFV抗體的檢測(cè)方法主要有酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、間接熒光試驗(yàn)、膠體金免疫層析技術(shù)等。

血清學(xué)抗原檢測(cè)：目前世界動(dòng)物衛(wèi)生組織推薦的用于抗原鑒定的方法為熒光抗體試驗(yàn)，主要用于鑒定不產(chǎn)生紅細(xì)胞吸附試驗(yàn)反應(yīng)的非洲豬瘟病毒毒株，通過(guò)熒光標(biāo)記單抗而檢測(cè)動(dòng)物組織內(nèi)的抗原；在ELISA基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的雙抗夾心ELISA方法，運(yùn)用抗原抗體特異性結(jié)合原理，先將特異性抗體與固相載體結(jié)合，在此基礎(chǔ)上加入待檢抗原，然后加入酶標(biāo)抗體，使得一單位的抗原同時(shí)結(jié)合兩個(gè)單位的抗體從而形成所謂的“雙抗體夾心”，最后加入底物試劑與酶標(biāo)抗體結(jié)合，根據(jù)顯色深淺來(lái)判斷抗原含量。此外，ASFV的交叉引物擴(kuò)增結(jié)合免疫層析快速檢測(cè)方法，不僅方便快捷，且有著良好的敏感性。免疫膠體金技術(shù)是一種常用的標(biāo)記技術(shù)，而膠體金免疫層析法則是運(yùn)用類似于側(cè)向流動(dòng)免疫色譜分析的虹吸原理，來(lái)檢測(cè)樣品中抗原的有無(wú)，適合快速檢測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查。

血清學(xué)抗體檢測(cè)：抗體檢測(cè)是血清學(xué)檢測(cè)中最常規(guī)的方法，目前針對(duì)p72、p30、p54、K205R等ASFV蛋白，國(guó)內(nèi)外都已建立了間接ELISA、競(jìng)爭(zhēng)ELISA、阻斷ELISA等多種方法。目前市場(chǎng)上已有很多商品化ELISA試劑盒，特異性與靈敏度都非常高，是人們進(jìn)行ASFV檢測(cè)時(shí)的首選方法。同時(shí)，免疫膠體金技術(shù)針對(duì)包被分子的不同也可以用來(lái)檢測(cè)ASFV抗體，該兩種方法均是生產(chǎn)一線中快速診斷非洲豬瘟的方法之一。

2 非洲豬瘟病毒檢測(cè)注意事項(xiàng)

非洲豬瘟病毒檢測(cè)涉及樣本采集、樣本保存、樣本運(yùn)輸、樣本處理與最終檢測(cè)等多個(gè)環(huán)節(jié)，一個(gè)環(huán)節(jié)出現(xiàn)紕漏，就極易出現(xiàn)假陽(yáng)性或者假陰性的錯(cuò)誤檢測(cè)結(jié)果。提高檢測(cè)可靠性，避免出現(xiàn)假陽(yáng)性或者假陰性結(jié)果，我們需要做到以下幾點(diǎn)。

2.1 樣品端

規(guī)范樣本采集操作。隨機(jī)采樣時(shí)要注意仔細(xì)觀察豬的精神狀態(tài)，對(duì)精神狀態(tài)不好伴有發(fā)燒癥狀的豬只要重點(diǎn)采集確保不漏任何一頭；或者隨機(jī)采樣時(shí)，對(duì)全群豬只進(jìn)行間隔采集，保證不漏采任何一頭疑似豬只。當(dāng)采集的樣品為組織樣時(shí)，應(yīng)將樣品50%中性甘油溶液或含I00 μg/mL青霉素和鏈霉素的PBS溶液中，樣品采集完成后要置于低溫環(huán)境中保存和運(yùn)輸（12h內(nèi)可4℃環(huán)境中運(yùn)輸），到達(dá)實(shí)驗(yàn)室至檢測(cè)前應(yīng)將樣品置于－20℃中保存，以保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2.2 試劑端

規(guī)范化檢測(cè)試劑的保存。很大一部分假陽(yáng)性與假陰性的檢測(cè)結(jié)果，是由于檢測(cè)試劑保存不當(dāng)造成的。因此我們要規(guī)范化檢測(cè)試劑的管理，做好試劑的生產(chǎn)日期及失效日期登記，并將試劑保存在適宜的環(huán)境中。

2.3 病毒檢測(cè)端

病毒檢測(cè)過(guò)程中若存在不符合操作規(guī)程的地方也會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果出錯(cuò)。核酸檢測(cè)是微量操作，要求極為嚴(yán)格。首先，要做好檢測(cè)人員的專業(yè)知識(shí)和實(shí)操技能的培訓(xùn)，保證檢測(cè)人員在樣品處理端和加樣端的操作符合規(guī)程。另外樣品RNA提取和逆轉(zhuǎn)錄的過(guò)程對(duì)操作人員的加樣速度、超純水以及潔凈度要求較高，如果環(huán)境中存在RNA酶則會(huì)使RNA降解從而導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果出錯(cuò)。因此，在病毒檢測(cè)端在保證操作環(huán)境潔凈的同時(shí)一定要確保檢測(cè)人員有著較高的實(shí)驗(yàn)室素養(yǎng)和實(shí)操水平。

3 總結(jié)

雖然分子生物學(xué)檢測(cè)非洲豬瘟病毒是診斷非洲豬瘟疾病最有效的、最便捷、最準(zhǔn)確的方法，但是要確保檢測(cè)結(jié)果的真實(shí)可靠就一定要將病毒檢測(cè)過(guò)程中每一個(gè)操作步驟都執(zhí)行到位，準(zhǔn)確可靠的結(jié)果能有效防止非洲豬瘟的進(jìn)一步擴(kuò)散，降低非洲豬瘟對(duì)生豬養(yǎng)殖業(yè)的威脅。